Separação de Endoderme e Ectoderme

De MTC

Materiais

Procaína

  • Procaína: 1 g diluído em 100 mL de água destilada.

Demais

Misturam-se três soluções em mesma proporção:

  • 50 mL de procaína
  • 50 mL de HM
  • 50 mL de DM

Divide-se a mistura em dois copos de Becker e ajusta-se o pH. Deixam-se ambas a 4°C.

  • Solução A: pH = 4,5
  • Solução B: pH = 2,5

Métodos

A temperatura do laboratório deve ser 18°C.

  1. As hidras devem estar em jejum por dois dias antes do experimento. Devendo ser limpas nos dias anteriores ao procedimento.
  2. Faça o corte das cabeças e pés das hidras.
  3. Lave os troncos 3 vezes em HM.
  4. Coloque-os por 5 minutos na solução A e 1,5 minutos (um minuto e meio) na solução B, ambas a 4°C (o controle da temperatura é muito importante).
  5. Transfira os troncos com cuidado para o petri com DM a 18°C.
  6. Dentro de poucos minutos os tecidos estarão separados (e ectoderme se contrai na forma de um anel). Usamos duas pinças para a separação - com a primeira seguramos a endoderme e com a segunda puxamos a ectoderme.
  7. Coloque os tecidos de ecto e de endo em tubos de ensaio com DM a 18°C. Pipete o líquido para que as forças de cisalhamento ajudem a separar as células. Deixe decantar por 1 minuto.
  8. Centrifugue à velocidade lenta de 1400 r.p.m. de 4 a 10 minutos.
  9. Leve à geladeira (4°C) por algo entre 30 e 60 minutos.
  10. Transfira a massa celular para o petri com DM a 18°C. Caso seja necessário, corte em tamanhos desejados.